Nukleinsäurehybridisierung

Ein sehr spezifisches Nachweisverfahren, das auf der Identifikation von viralen Genen in der zu untersuchenden Probe beruht. Hierzu wird die doppelsträngige DNA der infizierten Wirtszelle chemisch oder durch Wärmeeinwirkung in Einzelstränge zerlegt. Dieser Vorgang heißt Denaturierung. Die Probe wird anschließend z. B. auf Nitrozellulosefiltern gebunden. Anschließend wird radioaktiv markierte Nukleinsäure Jedes Lebewesen besitzt zwei Arten von Nukleinsäuren, DNA und RNA. Dabei fungiert in der Regel die DNA als Träger der des in der Probe nachzuweisenden Virus hinzugeben. Diese Testnukleinsäure wurde jedoch zuvor zur späteren Identifizierung radioaktiv markiert. Die zueinander kompatiblen (homologen) Teile von Nukleinsäuresträngen aus der Probe und der Testnukleinsäure lagern sich zu einem passenden Doppelstrang zusammen. Dieser Vorgang heißt Hybridisierung. Durch Zugabe des Enzyms DNAse werden die nicht hybridisierten DNA-Stücke in der Probe zerlegt. Die hybridisierten Nukleinsäuren werden dann anhand ihrer radioaktiven Markierung durch Auflegen auf einen fotografischen Film (Autoradiographie) nachgewiesen. Die radioaktiv markierten Nukleinsäurestücke hinterlassen auf der Fotoplatte eine Schwärzung, wodurch die Auswertung der Hybridisierung möglich ist. Die Spezifizierung des Tests hängt von der Qualität der Testnukleinsäurefragmente ab. Diese Fragmente nennt man „gene probes“ oder Gensonden. Die Gensonden können z. B. durch Klonierungsverfahren in bakteriellen Plasmiden, das sind kleine DNA Ringe, die autonom replizieren können, hergestellt werden. Sie werden anschließend durch kontrollierte bakterielle Multiplikation vervielfältigt. Dabei entsteht eine große Menge identischer Kopien der gewünschten Nukleinsäure-Fragmente (Gensonden), die man durch einfache Verfahren reinigen und entweder mit radioaktiven oder mit anderen nicht-radioaktiven Stoffen markieren kann.